利用顯微鏡觀察微生物

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第一節 前言

微生物大多無法直接用肉眼看見，顯微鏡可以將其放大，以利於觀察，因此顯微鏡鏡檢是研究微生物主要方法之一。顯微鏡有兩種，分別是光學顯微鏡（light microscopes）和電子顯微鏡（electron microscopes），光學顯微鏡可利用光線及透鏡將欲觀察的物體放大，而電子顯微鏡則利用電子放大物體。光學顯微鏡大多只能放大1000倍，而電子顯微鏡可放大至10萬倍或更高。

第二節 光學原理

解像力（resolving power）為可見物體的最小直徑（見○圖2-1○），也相當於波長∕光口角（numerical aperture；NA）；光口角等於n‧sinθ，其中θ為光透至物鏡形成的開口角度的一半；n為蓋玻片與物鏡前透鏡間介質的折射係數（refractive index），一般乾式透鏡的n=1，因為空氣的折射係數為1，所以NA一定小於1；若使用油鏡，n=1.56，NA值則在1.2~1.4間（見○圖2-2○）。一般光學顯微鏡之解像力需達0.17μm,否則大部份的細菌無法檢出，假如顯微鏡的解像力為0.2μm，直徑小於0.2μm的細菌就無法觀察得到。

第三節 光學顯微鏡

光學顯微鏡可由一片或多片凸透鏡，當光線透過鏡片時，產生放大的效果。簡單顯微鏡（simple microscopes）是由一片凸透鏡所組成，一般我們所使用的放大鏡便是，一般簡單顯微鏡只能放大到10倍左右，倍數過高會因解像力不足，而使影像模糊失真。複式顯微鏡（compound microscopes）（見○圖2-3○）則是由2~3片放大透鏡組成，通常只有兩片放大透鏡，分別稱為接物鏡（objective lens）和接目鏡（eyepiece lens），接目鏡乘以接物鏡的倍數，即得顯微鏡之總放大倍數。例如，物鏡是40×，目鏡是10×，則總放大倍數是400×。

若要仔細觀察細菌，需採用100×物鏡，加上10×目鏡，總放大倍數為1000×，為了達到良好的聚光效果，物鏡必需浸於一滴無色的油中，因此100×又稱為油鏡（oil immersion lens）。使用時，先將一滴純度高透明的礦物油，滴在欲觀察檢體的蓋玻片上，再將物鏡慢慢地浸入油中，微調焦距。

顯微鏡依特性分為﹕

1、              明視野顯微鏡（light field microscopes）﹕利用自然光或電燈光源，依光學原理，使檢體本身呈暗的狀態，背景為明亮的狀態。

2、              暗視野顯微鏡（dark field microscopes）﹕加裝集光器（condenser），引導光源進行的路徑，使檢體呈明亮，背景則呈暗影（見○圖2-4○）。

3、              紫外線顯微鏡（ultraviolet microscopes）﹕使用紫外線為光源，波長較短，所以有助於解像力，但是紫外線無法目視，需要將影像顯示在螢幕上。

4、              螢光顯微鏡（fluorescence microscopes）﹕有些處理過的檢體可以吸收紫外線，放出較長波長的可見光，此現象稱為螢光反應（fluorescence），這種使檢體產生螢光的螢光染色劑，可以用在抗體免疫技術之應用（見○圖2-5○）。

5、              位相差顯微鏡（phase contrast microscopes）﹕主要設置為一位相差物鏡（phase contrast objective lens）及聚光鏡（見○圖2-6○），利用菌體各部位密度的差異，產生光線折射的不同，使細胞不同部位的對比更強烈，藉而分辨細胞內不同的構造。

第四節 光學顯微鏡檢體製備和染色

微生物不論染色與否，均可在顯微鏡下觀察，未染色的觀察方法有二﹕

1、                濕抹片檢查（wet mount）﹕先加一滴水或生理食鹽水（saline）於載玻片上，再將檢體塗抹在水中，覆蓋一片蓋玻片，然後置於顯微鏡下觀察。濕抹片檢查法可以觀察到細菌的大小和形狀、部份的微細結構和微生物的運動性。濕抹片檢查可以使用明視野鏡檢，也可以使用暗視野鏡檢。

2、                懸滴法（hanging drop method）（見○圖2-7○）﹕先將一滴檢體滴於蓋玻片上，然後翻過來蓋在中央有凹槽的載玻片上，使水滴自由懸浮於蓋玻片下，允許其中微生物自由運動，此懸滴法主要用途是觀察微生物的鞭毛運動情形。

此外，細菌表面或內部有某些構造可與染劑發生離子交換，當染劑中帶顏色的染劑離子與細菌結構的離子產生交換，便可以將細菌的特殊結構染色。染色的目的有（1）鑑定不同菌體之形態；（2）鑑別不同菌體之結構；（3）提高顯微鏡的解像能力。

染劑的種類依帶電荷分為﹕（1）酸性染劑 – 用於鹼性結構的染色，例如細胞質之染色；（2）鹼性染劑 – 用於酸性結構的染色，例如細胞核和細胞粒；（3）中性染劑– 缺乏可解離的化學基，所以多數可與脂肪結合。

另外所謂媒染劑（mordant），意指可與染劑形成不溶性物質者，常先染劑用於檢體，以增加染劑對檢體之親和力，常使用的例子是鞭毛的染色。

染色的方法有三﹕

1、                簡單染色法（simple staining）﹕指溶液只使用一種染劑的染色法，常用的是鹼性染劑。

2、                鑑別染色法（differential staining）﹕鑑識菌體或菌體中特殊部位，而使用一種以上染劑的染色方法。常用的方法有六﹕

1.          革蘭氏染色法（Gram staining）﹕於1884年由丹麥微生物學家Hans Christian Gram所發明。此鑑別染色法可以將細菌分成革蘭氏陽性菌（G+）及革蘭氏陰性菌（G-），但是高等動物細胞則無法被革蘭氏染色劑染色。革蘭氏染色有四個步驟﹕首先在已固定的抹片上，滴加結晶紫（crystal violet），經過一分鐘讓細菌吸收染劑，然後用水沖掉，加入碘化鉀溶液，碘與結晶紫和細菌的細胞壁反應一分鐘後，用水洗掉，再加入脫色劑，通常是95﹪酒精或丙酮。無法被脫色的細菌，稱為革蘭氏陽性菌，保留染劑的原因與細菌的細胞壁構造有關；而能被脫色的細菌，稱為革蘭氏陰性菌，需要使用對比染色劑番紅（safranin）將被脫色的革蘭氏陰性菌染成粉紅色。

2.          抗酸染色法（acid-fasting staining）﹕又稱Ziehl-Neelsen staining，有些菌體外包脂肪質或蠟質物質，當用強脫色劑處理後，仍會保留染色的顏色，這些細菌就叫抗酸菌。染色後的抗酸菌呈粉紅色或紅色，非抗酸菌則為藍色。

3.          鞭毛染色法（flagella staining）﹕鞭毛形體大小接近光學顯微鏡解像力的限制，所以染色前需先使用染媒，使鞭毛有化學沉澱生成，增大鞭毛，然後用鹼性洋紅染色，染色後鞭毛呈紅色，而細胞為藍色。

4.          莢膜染色法（capsule staining）﹕莢膜為黏質外層，成份為多醣體，較難染色，可以使用印度墨水（India ink）行陰性染色（見○圖2-8○）。

5.          孢子染色法（spore staining）﹕使用孔雀綠（malachite green）和番紅（safranine O）染色，孢子染成綠色，而菌體為紅色。

6.          細胞壁染色法（cell wall staining）﹕細胞壁厚，染色不易，但可以先用染媒劑處理，使細胞壁呈正電荷，再用酸性染劑處理。

3、                陰性染色法（negative staining）﹕菌體本身不染色，而是將背景部份染色。例如使用印度墨水或黑色素（nigrosin）染色，以油鏡或暗視野鏡檢。

第五節 電子顯微鏡

電子顯微鏡是利用電磁波，提高放大的倍率及加強解像力。1932年Bruche及Johannson合作製造第一架電子顯微鏡，現代電子顯微鏡的構造見○圖2-9○。電子顯微鏡的顯微鏡的解像力可達3Å，電子光束擴大檢體的影像，結聚至鏡筒末端之螢幕上，可以在投影的終端機上檢視，其投射的路徑和光學顯微鏡的差異可參考○圖2-10○。

電子顯微鏡的原理如下﹕陰電極釋放出5萬伏特的加速電子光束，由磁性收集器（magnetic condenser）整理，使電子光束形成一直線，均勻通過檢體，由於檢體密度不同，電子光束被檢體吸收的程度也會有異，通過檢體的電子光束強度於是產生相對的差異，這些通過的電子光束再經過磁性物鏡的牽引，產生偏離，使得電子束的角度放大，因而得到放大效果。但是電子光束無法目視，需要以螢幕顯像，螢幕影像的亮度取決於撞擊電子光束的強度。

第六節 電子顯微鏡檢體製備

電子顯微鏡的檢體需在真空下鏡檢，通常有3種製備的方法﹕（1）直接鏡檢法；（2）複式印製法（replica method）；（3）投影法（shadow-casting method）。電子顯微鏡雖然可以將檢體的影像放大，但是必需在真空中進行，因此無法檢視活菌體，此外，強烈電子光束照射，產生高熱，容易使檢體變形，最後，電子光束的穿透力低，因此觀察細胞內部構造時，需使用薄切片才可。

第七節 結語

主要幾種顯微鏡的比較如下﹕

種類	最大放大倍數	檢體處理	應用對象
1、明視野顯微鏡	1,000~2,000	染或未染色	觀察未染色的細菌、黴菌、酵母菌、藻類及原生動物
2、暗視野顯微鏡	1,000~2,000	通常未加染色	觀察活菌體特殊部位，如Spirochetes
3、螢光顯微鏡	1,000~2,000	明亮具螢光反應	由螢光反應而有助於臨床診斷技術
4、位相差顯微鏡	1,000~2,000	不同的暗度	檢視較大活菌體之細胞構造，如酵母菌、藻類、原生動物及一些細菌
5、電子顯微鏡	200,000~40,000	於螢幕上顯示檢體	檢視很小的菌體，如病毒及菌體之超微小構造。

第八節 微生物相關資訊

參考書目﹕

1.Tortora G.J., Funke B.R. & Case C.L. 1998, Microbiology – An Introduction, 6^thedition. Publishing Co., Benjamin/Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA

2.王進琦編著，2000，基礎微生物學，藝軒圖書出版社。

3.蔡文城編著，2000，微生物學，藝軒圖書出版社。

 

微生物相關網站﹕

○Microscopy Online○

URL:http://www.microscopy-online.com/

provides the commercial and non-commercial microscopy communities with a forum for information exchange.  

○History of the Light Microscope○

URL: http://www.utmem.edu/~thjones/hist/hist_mic.htm

covers the early history of the microscope, starting with use of a simple lens in ancient times, to the first compound microscope, up to the microscopes of the 19th century.

 

○Argonne National Laboratory - Microscopy and Microanalysis○

URL: http://www.amc.anl.gov/

includes information about the Advanced Analytical Electron Microscope and Tele-Presence Microscopy Projects.